Современные исследования применяемые в гистологии. Гистология как наука

Тема 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

Основным методом исследования в гистологии является микроскопирование – изучение гистологических препаратов под микроскопом. В последнее время микроскопия сочетается с другими методами – гистохимией и гисторадиографией. Для микроскопии используют различные конструкции микроскопов, позволяющие изучать различные параметры гистологических препаратов.

Выделяются следующие виды микроскопии:

1) световая микроскопия (наиболее распространенный вид микроскопии, при этом разрешающая способность микроскопа составляет 0,2 мкм);

2) ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность микроскопа составляет 0,1 мкм);

3) люминисцентная микроскопия (применяется для определения в исследуемом гистологическом препарате определенных химических структур);

4) фазово-контрастная микроскопия (применяется для обнаружения и изучения определенных структур в неокрашенных гистологических препаратах);

5) поляризационная микроскопия (используется в основном для изучения волокнистых структур);

6) микроскопия в темном поле применяется для изучения живых объектов;

7) микроскопия в падающем свете (предназначена для изучения толстых объектов);

8) электронная микроскопия (наиболее современный вид микроскопии, имеющий разрешающую способность 0,1 – 0,7 нм). Имеются две разновидности электронной микроскопии – просвечивающая (трансмиссионная) и сканирующая (или растворная) микроскопия, дающая отображение поверхностных ультраструктур.

Гистологические и цитохимические методы применяются для определения состава химических веществ и их количества в определенных структурах. Принцип метода заключается в химической реакции между реактивом и субстратом, содержащимся в исследуемом веществе. При этом образующиеся побочные продукты реакции можно обнаружить с помощью световой или люминисцентной микроскопии.

Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в исследуемых структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов. Данный метод чаще всего используется при экспериментах на животных.

Метод интерферонометрии позволяет определять сухую массу вещества в живых или фиксированных объектах.

Метод культуры клеток – это выращивание клеток в пробирках или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.

Метод витального окрашивания – введение животным в кровь или в брюшную полость красителя (трепанового синего), который при жизни животного захватывается определенными клетками – макрофагами, а после забоя животного и приготовления препарата определяются и подсчитываются клетки, содержащие краситель.

Иммуноморфологические методы позволяют с помощью предварительно проведенных иммунных реакций (на основе взаимодействия антиген – антитело) определять субпопуляцию лимфоцитов, степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов, т. е. определять их гистосовместимость для дальнейшей трасплантации.

Метод дифференциального центрифугирования – изучение отдельных органелл или даже их фрагментов, выделенных из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2 до 150 тыс. в 1 мин). В результате центрифугирования получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.

Методы морфометрии – количественные методы. Они позволяют определять размеры и объемы ядра – кариометрия, клеток – цитометрия, органелл – электронная морфометрия, а также определять число клеток различных популяций и субпопуляций. Данные методы широко используются в научных исследованиях.

Различные экспериментальные методы – пищевая и водная нагрузка, физические методы (УВЧ, СВЧ, лазеры, магниты). Они применяются для изучения реакции интересующих структур на то или иное воздействие и сочетаются с методами морфометрии, цито– и гистохимии. Данные методы также применяются в научных исследованиях.

Таким образом, основным и наиболее распространенным методом изучения в гистологии является микроскопия. Приготовление гистологического препарата включает в себя следующие этапы.

1. Взятие материала – кусочка ткани или органа. При заборе материала необходимо выполнять следующие правила:

1) забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, при возможности от живого объекта, чтобы как можно лучше сохранить структуру исследуемых клеток;

2) забор материала должен проводиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани;

3) толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор смог проникнуть на всю глубину ткани;

4) обязательно необходимо произвести маркировку кусочка, при этом указываются наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора.

2. Фиксация материала . Данный этап проводится для того, чтобы остановить обменные процессы в клетке и сохранить ее от распада. Для этого взятый на исследование кусочек ткани погружают в фиксирующий раствор. Раствор может быть простым (спирт или формалин) и сложным (раствор Карнуа, фиксатор Цинкера). Фиксатор вызывает денатурацию белков и сохраняет структуру клеток в состоянии, близком к прижизненному. Фиксацию можно проводить также путем замораживания – охлаждением жидким азотом или струей углекислого газа.

3. Заливка кусочков ткани в уплотняющие среды (парафин, смолы) – или замораживание. Данный этап необходим для того, чтобы в последующем из исследуемой ткани можно было изготовить тонкий срез.

4. Приготовление срезов на микротоме или ультрамикротоме с помощью специальных ножей . После этого срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной – монтируются на специальные сеточки.

5. Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии). Перед окраской срезов необходимо удалить уплотняющую среду – выполнить депарафирование. С помощью окраски достигается контрастность изучаемых структур. Красители можно подразделить на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко применяются основные красители (гематоксилин) и кислые (эозин). Часто используются и сложные красители.

6. Просветление срезов в ксилоле и толуоле . Их заключают в смолы (бальзам и полистирол) и закрывают покровным стеклом.

После данных процедур препарат можно исследовать под световым микроскопом. Помещенные под стекло срезы для светового микроскопа могут долго храниться и многократно использоваться. Для электронной микроскопии каждый срез используется только 1 раз, при этом он фотографируется, и изучение структур ткани производится по электронограмме.

Если ткань имеет жидкую консистенцию (например, кровь, костный мозг), то препарат изготавливают в виде мазка на предметном стекле, который затем также фиксируется, окрашивается и изучается.

Из ломких паренхиматозных органов изготавливают препараты в виде отпечатка органа, проводят разлом данного органа, затем к месту разлома прикладывают предметное стекло, на которое приклеиваются свободные клетки. После этого препарат фиксируется и изучается.

Из некоторых органов (например, брыжейки, мягкой мозговой оболочки) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливают пленочные препараты путем растягивания или раздавления между двумя стеклами с последующей фиксацией и заливкой в смолы.

Сегодня уже невозможно себе представить полноценное лечение злокачественного образования без гистологического исследования. Вместе с тем мало кто имеет четкое представление о таком методе диагностики. В статье расскажем о том, как осуществляется проведение гистологического исследования, и о том, зачем оно необходимо. Также поговорим об использовании диагностики такого рода в гинекологии.

Что собой представляет

Гистологический метод исследования заключается в изучении внутренних тканей организма больного, которые берутся в виде маленького образца. Зачастую материал получают посредством биопсии. В диагностике раковых опухолей и оценке правильности медикаментозной терапии гистологическое исследование - один из самых важных этапов.

Цели проведения

Такая диагностика проводится для уточнения или подтверждения ранее поставленного диагноза. Также она помогает верно определить заболевание в спорных ситуациях. Гистологическое исследование материала больного дает возможность на ранней стадии выявить наличие злокачественного образования, изучить динамику его роста (определить, есть ли разрастание, увеличение, распространение опухоли). Кроме того, с помощью него осуществляют дифференциальную диагностику патологических процессов и анализируют изменения, происходящие в ходе лечения в тканях.

Значение в медицине

В настоящее время перед проведением химиотерапевтического или лучевого лечения больных со злокачественными образованиями обязательно назначается гистологическое исследование опухоли. Также без него не проводится ни одна хирургическая операция, связанная с онкологией. Помимо этого, тщательное изучение тканей пациентов нужно для того, чтобы вовремя обнаружить даже малейшие изменения в опухолевом процессе и своевременно принять меры.

Но в лечении не только раковых больных используется гистологическое исследование. Биопсия крайне важна при выборе оптимальной лечебной программы для пациентов с заболеваниями, изучением которых занимаются такие отрасли и разделы медицины, как гинекология, гастроэнтерология, урология, пульмонология, оториноларингология, гематология, нефрология, торакальная и абдоминальная хирургия и др.

Выполнение забора материала

Необходимый для осуществления исследования материал можно получить из любых тканей и внутренних органов пациента. Сегодня имеется много способов произвести данную процедуру:

• Иссечение необходимого количества тканей в процессе хирургической операции (эксцизионная биопсия).
• Прокол полости пораженного органа или злокачественного опухолевого образования при помощи специальной длинной иглы. Такие иглы представлены в различных конструкциях и видах. Посредством пункционной биопсии проводится, к примеру, гистологическое исследование печени.
• Вырезание или отрезание из удаленных внутренних органов небольших кусочков ткани.
• Скусывание специальными щипцами нужного количества ткани при выполнении эндоскопических манипуляций: колоноскопии, бронхоскопии, эзофагогастродуоденоскопии. Такой способ носит название щипцовой биопсии.
• Отсасывание небольшого количества материала из полых внутренних органов (аспирационная биопсия).
• Кюретаж внутренних стенок патологических и естественных полостей. Таким способом проводят, например, гистологическое исследование шейки матки и остеомиелитической полости.

Особенности процедуры

Чтобы получить наиболее достоверные и правильные результаты, необходимо строго выполнять правила забора биологического материала. Образцы ткани, как уже говорилось, можно взять в ходе хирургической операции, когда, к примеру, удаляют часть органа или его целиком, или же в результате биопсии. Большинство врачей предпочитают вторую методику забора материала, она является гораздо более распространенной.

Гистологическое исследование может осуществляться посредством изучения как целого опухолевого образования, так и небольшого столбика ткани. Часто биопсию выполняют с помощью очень длинной и тонкой иглы, которая предназначена для внутримышечных инъекций. Но в отдельных случаях применяют иглу большего диаметра - это делает процедуру более болезненной, но и более эффективной, поскольку специалисты получают возможность провести еще и иммуногистохимический анализ.

Методы диагностики

Есть два методы выполнения гистологического исследования - традиционный и ускоренный. В первом случае полученные образцы ткани сначала заливают расплавленным парафином, а потом нарезают на пластины толщиной 1-8 мкм и подвергают окрашиванию. При применении такого способа данные анализа будут готовы через пять-десять дней.

При использовании ускоренной методики результат гистологического исследования может быть получен в течение часа. В этом случае биологический материал, взятый у пациента, экстренно замораживают, а затем делают в нем послойные тончайшие разрезы и внимательно изучают под микроскопом. Такой метод незаменим, когда хирургу при выполнении операции нужно срочно принять решение относительно того, удалять орган больного или сохранять.

Если гистологическое исследование планируется выполнять не в ближайшее время, а позже, то ткани с целью сохранения структуры заливают спиртом, раствором формалина или осмиевой кислотой. Что касается твердых материй, то их тщательно размягчают.

Результаты анализа

Гистологический метод исследования имеет высокую точность. Это обусловлено тем, что ткани пораженного органа изучаются под микроскопом, а не рассматриваются сквозь другие ткани и органы, как это происходит во время рентгена или ультразвукового исследования. Именно по этой причине гистологический анализ считается наиболее важным для постановки итогового диагноза. Кроме этого, благодаря микроскопии и обязательному окрашиванию тканей пациента специалисты имеют возможность получить самые точные данные о текущем состоянии пораженного органа. Зная утвержденные стандарты структуры тканей и внутренних органов в здоровом состоянии, врач легко может провести оценку патологических изменений и оперативно установить наличие заболевания, а также его степень.

По результатам исследования специалист дает заключение. В нем может стоять ориентировочный или заключительный диагноз, а в ряде случаев дается только описательный ответ, позволяющий высказать лишь предположение о характере патологии (при недостаточности клинических сведений или материала).

Ориентировочный диагноз дает возможность определить круг заболеваний для выполнения дифференциального исследования, а заключительный ответ выступает основой для формулировки клинического диагноза.

Ошибочные данные

Многих пациентов интересует вопрос о том, могут ли быть получены ошибочные результаты при гистологическом исследовании. Такое случается, как правило, если врач неверно выполнил забора биоматериала. Например, взял много здоровых тканей, а пораженный участок органа практически полностью пропустил. Также причиной ошибки могут стать неправильные условия хранения тканей больного или же серьезные нарушения, допущенные во время их подготовки к хранению.

Помимо этого, для получения достоверного результата огромное значение имеет количество срезов - чем их будет больше, тем лучше, поскольку если срезов недостаточно, пораженный участок ткани можно и пропустить, в таком случае тщательного изучения не будет проведено.

Нередко ошибки при осуществлении такой диагностики объясняются недостаточной квалификацией гистолога и отсутствием взаимопонимания между ним и врачом, производящим лечение больного.

Гистологические исследования в гинекологии

В этой отрасли медицины рассматриваемый метод диагностики имеет большое значение. В гинекологии нашли свое применение все гистопатологические виды исследования. Их использование дает возможность установить диагноз с наибольшей степенью достоверности в случае различных патологий женской репродуктивной системы. Особо важную роль играет гистологическое исследование матки, ее придатков, а также шейки матки. Такая диагностика позволяет выявлять онкологические заболевания, а также определять причины замерших беременностей и самопроизвольных выкидышей.

Гистологическое исследование эндометрия

Такой вариант диагностики в гинекологии дает возможность правильно оценить функционирование яичников и своевременно выявить любые патологические процессы, происходящие в них. Если у женщины еще продолжается менструальный цикл, гистологическое исследование эндометрия осуществляют примерно за три дня до начала очередных месячных. В том случае если у пациентки имеют место дисфункциональные кровотечения, соскоб требуется брать непосредственно во время кровотечения.

Полученные посредством диагностического выскабливания биологические ткани для проведения исследования окрашивают при помощи гематоксилина или эозина. В некоторых случаях применяется методика Ван Гизона. После окрашивания путем анализа определяют строение стромы и желез, выявляют все особенности эндометрия. Во время лютеиновой фазы менструального цикла здоровые железы отличаются пиловидной формой, они слегка расширены. Сами клетки железистого эпителия при этом имеют светлую цитоплазму и бледные ядра, а в железах в обязательном порядке обнаруживается секрет.

Гистология шейки матки

Диагностика проводится путем забора из нижнего сегмента детородного органа небольшого количества тканей. Если при проведении анализа в них обнаруживаются незначительные патологические изменения, то можно утверждать о наличии у пациентки доброкачественного образования или воспалительного заболевания. В том случае если клеток с патологическими изменениями выявлено много, говорят о развитии злокачественной опухоли или предраковом состоянии.

Гистология матки

Гистологическое исследование детородного органа осуществляется исключительно по показаниям. Такая диагностика выполняется, если, к примеру, женщину мучают боли в нижней части живота или у нее наблюдаются длительные маточные кровотечения, если выявляется опухолевое образование при прощупывании живота и так далее.

Биологический материал берется для исследования во время диагностической гистероскопии - это малоинвазивное обследование внутренней поверхности детородного органа посредством гистероскопа - специального оптического прибора. Надо отметить, что процедура является довольно сложной, осуществляется зачастую под общим наркозом (в редких случаях применяют местное обезболивание). Инструментами, входящими в состав гистероскопа, специалист берет кусочки ткани, которые затем отправляются на гистологическое исследование, в ходе которого можно точно установить, что послужило причиной неприятных симптомов. Такая диагностика также позволяет отличить доброкачественное образование (к примеру, миому) от злокачественного.

Гистология яичников

В этом случае забор биологического материала для гистологического анализа выполняют посредством пункционной биопсии (делают прокол передней брюшной стенки). В настоящее время такая процедура осуществляется под контролем ультразвукового исследования - это дает возможность получить ткань непосредственно из тех участков, которые вызывают подозрение. Проведение такой диагностики позволяет отличить доброкачественную опухоль и кисту от рака яичника.

Основными Объектами исследования являются гистологические препараты, а главным методом исследования - микроскопирование.

Гистологический препарат должен быть достаточно прозрачным (тонким) и контрастным. Он изготавливается как из живых, так и из мёртвых (фиксированных) структур. Препарат может представлять собой взвесь клеток, мазок, отпечаток, плёнку, тотальный препарат и тонкий срез.

Процесс изготовления гистологических препаратов для микроскопических исследований включает в себя следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация; 2) уплотнение материала; 3) приготовление срезов; 4)окрашивание, или контрастирование срезов; 5) заключение срезов.

Для окрашивания применяются специальные гистологические красители с различным значением рН: кислые, нейтральные и основные. Структуры, окрашивающиеся ими, соответственно, называются оксифильными, нейтрофильными (гетерофильными) и базофильными.

Какими же методами пользуется гистологическая наука? Они довольно многочисленны и разнообразны:

Микроскопирование.

Световая микроскопия. Современные микроскопы обладают высокоразрешающей способностью. Разрешающая способность определяется наименьшим расстоянием (d) между двумя рядом расположенными точками, которые можно видеть раздельно. Это расстояние зависит от длины световой волны (λ) и выражается формулой: d = 1/2 λ.

Минимальная длина волны видимой части спектра 0,4 мкм. Следовательно, разрешающая способность светового микроскопа составляет 0,2 мкм, а общее увеличение достигает 2500 раз.

Ультрафиолетовая микроскопия . Длина волны ультрафиолетового света – 0,2 мкм, следовательно, разрешающая способность ультрафиолетового микроскопа 0,1 мкм, но так как ультрафиолетовое излучение является невидимым, то для наблюдения исследуемого объекта необходим люминесцентный экран.

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Коротковолновое (невидимое) излучение, поглощаясь рядом веществ, возбуждает их электроны, которые излучают свет с большей длиной волны, становясь видимой частью спектра. Таким образом, добиваются повышения разрешающей способности микроскопа.

Фазовоконтрастная микроскопия позволяет излучать неокрашенные объекты.

Поляризационная микроскопия применяется для изучения архитектоники гистологических структур, например, коллагенового волокна.

Электронная микроскопия даёт возможности изучать объекты, увеличенные в десятки тысяч раз.

Микрофотосъёмка и микрокиносъёмка . Эти методы позволяют изучать фиксированные объекты на фотографиях и живые микроскопические объекты в движении.

Методы качественных и количественных исследований.

Гисто – и цитохимия , в том числе количественная, позволяет проводить качественный анализ исследуемых объектов на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях.

Цитоспектрофотометрия Даёт возможность изучать количественное содержание тех или иных биологических веществ в клетках и тканях на основе поглощения света определённой длины волны связанным ими красителем.

Дифференциальное центрифугирование позволяет разделять содержимое клеток, отличающихся между собой своей массой.

Радиография Основана на включении радиоактивной метки (например, радиоактивного йода, Н³-тимидина и др.) в обменный процесс.

Морфометрия позволяет производить измерение площадей и объёмов клеток, их ядер и органелл с помощью окуляр - и объект-микрометров и специальных сеток.

Применение ЭВМ для автоматической обработки цифрового материала.

Метод культуры тканей представляет собой поддержание жизнеспособности и деления клеток и тканей вне организма. Для этого используют специальные контейнеры с питательной средой, в которых создаются все необходимые условия для жизнедеятельности клеток. С помощью этого метода можно изучать дифференцировку и функциональное становление клеток, закономерности их злокачественного перерождения и развития опухолевого процесса, межклеточное взаимодействие, поражение клеток и тканей вирусами и микроорганизмами, влияние лекарственных препаратов на обменные процессы в клетках и тканях и т. д.

Прижизненное (витальное) окрашивание используется для изучения явлений фагоцитоза и активности макрофагов, фильтрационной способности почечных канальцев и др.

Метод трансплантации тканей . Этот метод применяют с целью изучения поведения клеток и их морфофункционального состояния при их пересадке в другой организм. К примеру, этот метод используется для поддержания жизни животных, подверженных облучению смертельной дозой.

Микроманипуляции. Данный метод получил применение в молекулярной биологии, генной инженерии, а также при клонировании, когда с помощью микроманипулятора удаляют ядро из яйцеклетки с гаплоидным набором хромосом и пересаживают в неё ядро соматической клетки с диплоидным набором хромосом.

Гистологические методы исследования

гистологический срез электронная микроскопия клетка

Гистохимические методы

Методы идентификации химических веществ в гистологических срезах. Составной частью Г. м. и. являются цитохимические методы, выявляющие химические вещества в клетках приготовленных мазков и отпечатков. В основе гистохимического исследования лежит соединение принципов и методов химического анализа с принципами и методами морфологического изучения клеток и тканей, используемыми в цитологии и гистологии. Благодаря этому обеспечиваются существенные преимущества в изучении морфофункциональной организации растительных и животных тканей, т.к. выявленное химическое вещество можно связать с определенной тканевой или клеточной структурой, т.е. установить его локализацию. Гистохимические методы находят широкое применение в гистологии, цитологии, эмбриологии, патологической анатомии, экспериментальной и клинической морфологии. С помощью разнообразных методов современной гистохимии можно судить об особенностях функционирования различных тканевых и клеточных структур, определять характер и темп обменных процессов в клетках и тканях, обнаруживать ранние проявления заболеваний.

Непременным условием проведения гистохимического исследования, особенно при выявлении ферментов и других веществ белковой природы, является сохранение структуры тканей и клеток в состоянии, близком тому, какое имеется в живом организме. Это достигается получением срезов свежезамороженных тканей с помощью ножа глубокого охлаждения и криостата, а также использованием лиофильной сушки. Некоторые гистохимические исследования., например выявление углеводных соединений, можно проводить после специальной фиксации тканей и заливки в парафин.

Многие гистохимические исследования являются групповыми, т.е. служат для обнаружения соединений с одинаковыми или близкими свойствами. Другие Г. м. и. строго специфичны и применяются для выявления определенных веществ. Для обнаружения углеводных соединений широко используются методы, основанные на метахромазии - свойстве клеток и тканей окрашиваться в цвет, отличающийся от цвета красителя. Метахромазия обусловлена полимеризацией молекул красителя под влиянием свободных отрицательных зарядов гликозаминогликанов (кислых муко-полисахаридов), присутствующих в ткани.

К высокоспецифичным относятся гистохимические методы выявления ферментов. В их основу положено воздействие фермента на специфический субстрат в присутствии другого вещества, называемого захватывающим агентом (акцептором). Соединяясь с первичным продуктом ферментативной реакции, акцептор образует нерастворимый, обычно окрашенный, осадок - конечный продукт реакции, который маркирует место действия фермента. В качестве акцепторов применяют ионы металлов, соли диазония и другие соединения. Ионы металлов обладают высокой электронной плотностью, поэтому могут быть обнаружены при электронно-микроскопическом исследовании. Это свойство используется в электронной гистохимии. Для определения в тканевом срезе дегидрогеназ применяют соли тетразолия, которые в присутствии специфического субстрата восстанавливаются с превращением в нерастворимые окрашенные продукты - формазаны. Оценка результатов гистохимических реакций, основанная на избирательном окрашивании структур или выпадении окрашенного продукта реакции, может быть не только качественной, но и количественной при использовании цито-спектрофотометрии. Возможна также визуальная полуколичественная оценка интенсивности окрашивания в баллах.

Электронная микроскопия

Электронная микроскопия - совокупность методов исследования с помощью электронных микроскопов микроструктур тел, их локального состава и локализованных на поверхностях или в микрообъемах тел электрических и магнитных полей.

На первом этапе электронная микроскопия применялась в основном для наблюдения биологических объектов, причем для интерпретации снимков использовался лишь адсорбционный контраст. Однако появление метода реплик - отпечатков, сделанных с поверхности, и особенно декорирование их металлами (1940-е -1950-е г.г.) позво-лило успешно изучать неорганические материалы - сколы и изломы кристаллов. Примерно с начала 1950-х годов начинаются интенсивные попытки исследования тонких фольг материалов на просвет. Это стало возможным в результате существенного повышения, до 100кВ, ускоряющего напряжения в электронных микроскопах. С этого периода начинается бурное развитие электронно-микроскопической техники, электронная микроскопия находит все более широкое применение в физическом материаловедении. Одной из важнейших причин этого, по-видимому, является возможность наблюдать в одном эксперименте, как изображение объекта в реальном пространстве, так и его дифракционную картину. Поэтому электронная микроскопия является наиболее подходящим методом исследования структур сложных кристаллических объектов.

Электронную микроскопию можно разделить на 3 группы:

- Просвечивающая электронная микроскопия (Transmission electron microscopy)

ПЭМ является наиболее универсальным классическим методом исследования структурных дефектов кристаллов, используется непосредственно для анализа морфологических особенностей, ориентации дефектов относительно решетки матрицы, определения их размеров. Для работы на просвечивающих электронных микроскопах требуются специально приготовленные тонкие препараты - реплики или фольги, прозрачные для электронов. Наиболее распространены электронные микроскопы с ускоряющим напряжением 100 и 200, 300 и 400 кВ, при этом исследуемые образцы должны иметь различную толщину в зависимости от величины ускоряющего напряжения (для 100 кВ в случае кремния оптимальная толщина 0,3-0,4 мкм, для 200 кВ - от 0,6-0,8мкм до 1мкм). Реплики используются для наблюдения микрорельефа, фактуры поверхности исследуемого образца. Сама реплика - это тонкая пленка какого-то вещества, на которой получают отпечаток микрорельефа поверхности. Это осуществляется, например, путем напыления угольной пленки или нанесения пленки лака или желатина. Метод реплик позволяет получать информацию о структуре поверхности образцов. Фольги - тонкие пленки, которые получают из массивных образцов, причем утонение образца необходимо вести таким образом, чтобы не внести в исследуемую область дополнительных нарушений. Утоненный образец, как и снятую реплику, помещают на специальную сетку с крупными отверстиями и размещают в колонне микроскопа. Именно на фольгах ведутся исследования дефектообразования в кристаллах.

Длина волны электронов с энергией 100 кэВ примерно равна 0,004 нм, а разрешающая способность обычного просвечивающего электронного микроскопа составляет 0,15 нм. В дефектной области наблюдается изменение интенсивности контраста, поскольку в области дефекта или искажена решетка, или наличествует поле упругих напряжений вокруг дислокаций и выделений. При малой деформации решетки матрицы дефект может не выявляться. Кроме того, поскольку просматривается маленький участок при наблюдении дефектов с плотностью менее 108см3, для обнаружения дефекта требуется просмотр большого количества фольг.

Просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения

ВРЭМ практически новый метод исследования, позволяет наблюдать непосредственно кристаллическую решетку материала - получать изображение отдельных плоскостей кристаллической решетки. Наименьшее межплоскостное расстояние, которое удалось разрешить с помощью электронной микроскопии высокого разрешения, -0,1-0,2 нм. Особенностью ВРЭМ является использование специальной оптики нового поколения, а определяющим при формировании изображения является не дифракционный, а абсорбционный контраст.

- Растровая электронная микроскопия

Использование растровой развертки электронного луча по поверхности образца является одним из способов автоматизации измерений. По своим возможностям РЭМ является продолжением оптической микроскопии, расширяющей ее возможности в исследовании топологии поверхностей кристаллических материалов. Разрешение наиболее распространенных РЭМ достигает 5-10 нм при недостижимой для других видов микроскопов глубине резкости 0,6-0,8 мм, причем при изучении топологии поверхности вполне достаточно использование низковольтных РЭМ с диаметром пучка электронов 10 мкм. Обычно используют пучок электронов с энергией 10-30 кэВ, хотя в отдельных случаях могут использоваться электроны с энергией в несколько сотен эВ. В РЭМ изображение объекта формируется последовательно по точкам и является результатом взаимодействия электронного пучка (зонда) с поверхностью образца. Каждая точка образца последовательно облучается сфокусированным электронным пучком, который перемещается по исследуемой поверхности подобно сканированию электронного луча в телевизионных системах. При взаимодействии электронов зонда с веществом возникают ответные сигналы различной физической природы, которые используются для синхронного построения изображения на экране монитора. Для формирования изображения не используется электронно-оптическая система, изменение масштабов изображения осуществляется радиотехническими средствами. Поэтому растровые электронные микроскопы принципиально отличаются от микроскопов, как дифракционных приборов, в обычном понимании этого термина. По существу РЭМ - это телевизионный микроскоп.

Ультрафиолетовая микроскопия

Ультрафиолетовая микроскопия - микроскопия при которой объект освещают ультрафиолетовыми лучами, а его видимое изображение получают с помощью люминесцентного экрана или посредством микрофотографии; применяется для повышения контрастности изображения, особенно внутриклеточных структур.

Метод наблюдения в ультрафиолетовых (УФ) лучах позволяет увеличить предель-ную разрешающую способность микроскопа, т. е. понизить его предельное разреше-ние, которое зависит от длины волны λ применяемого излучения (для используемых в микроскопии УФ лучей λ = 400-250 нм, тогда как для видимого света λ = 700-400 нм). Но главным образом этот метод расширяет возможности микроскопических ис-следований за счёт того, что частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определённых длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях. Характерными спектрами поглощения в УФ области обладает, например, ряд веществ, содержащихся в растительных и животных клетках (Пуриновые основания, пиримидиновые основания, большинство витаминов (См. Витамины), ароматические Аминокислоты, некоторые Липиды, Тироксин и др.); это обусловило широкое применение УФ микроскопии в качестве одного из методов цитохимического анализа.

Ультрафиолетовые лучи невидимы для человеческого глаза. Поэтому изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографически, либо с помощью электроннооптического преобразователя или люминесцирующего экрана. Распространён следующий способ цветового представления таких изображений. Препарат фотографируется в трёх длинах волн УФ области спектра; каждый из полученных негативов освещается видимым светом определённого цвета (например, синим, зелёным и красным), и все они одновременно проектируются на один экран. В результате на экране создаётся цветное изображение объекта в условных цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете.

Люминесцентная микроскопия

Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) заключается в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. При этом методе в оптическую схему микроскопа вводятся два Светофильтра. Первый из них помещают перед конденсором; он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, установленный после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют как освещение препаратов сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен - возбуждение свечения препарата не является простым отражением света); его часто сочетают с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете.

Метод широко применяется в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Обилие и разнообразие применений связаны с чрезвычайно высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне, а также ценностью информации о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения.

Фазово-контрастная микроскопия

Метод фазового контраста служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Метод основан на том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Эти фазовые измене-ния, не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды свето-вой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различи-мы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Другими словами, в полу-чаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Такое изображение называется фазово-контрастным. В типичной для этого метода схеме в переднем фокусе конденсора 3 устанавливается апертурная диафрагма 2, отверстие которой имеет форму кольца. Её изображение возникает вблизи заднего фокуса объектива 5, и там же устанавливается т. н. фазовая пластинка 6, на поверхности которой имеется кольцевой выступ или кольцевая канавка, называемая фазовым кольцом. Фазовая пластинка может быть помещена и не в фокусе объектива (часто фазовое кольцо наносят прямо на поверхность одной из линз объектива), но в любом случае неотклонённые в препарате 4 лучи от осветителя 1, дающие изображение диафрагмы 2, должны полностью проходить через фазовое кольцо, кото-рое значительно ослабляет их (его делают поглощающим) и изменяет их фазу на λ/4 (λ - длина волны света). В то же время лучи, даже ненамного отклоненные (рассеянные) в препарате, проходят через фазовую пластинку, минуя фазовое кольцо (штриховые линии), и не претерпевают дополнительного сдвига фазы.

С учётом фазового сдвига в материале препарата полная разность фаз между отклоненными и неотклонёнными лучами оказывается близкой к 0 или λ/2, и в результате интерференции света (См. Интерференция света) в плоскости изображения 4" препарата 4 они заметно усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры препарата. Отклоненные лучи имеют значительно меньшую амплитуду по сравнению с неотклонёнными, поэтому ослабление основного пучка в фазовом кольце, сближая значения амплитуд, также приводит к большей контрастности изображения.

Метод позволяет различать малые элементы структуры, чрезвычайно слабо контрастные в методе светлого поля.

Прозрачные частицы, сравнительно не малые по размерам, рассеивают лучи света на столь небольшие углы, что эти лучи проходят вместе с неотклонёнными через фазовое кольцо. Для подобных частиц фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.

Поляризационная микроскопия

Микроскопия, основанная на способности разных компонентов клеток и тканей преломлять поляризованные лучи. В поляризационном микроскопе можно исследовать объекты, которым свойственно двойное лучепреломление.

Радиоавтография

Метод изучения распределения радиоактивных веществ (изотопов) в исследуемом объекте или соединениях. Заключается в наложении на объект чувствительной к радиоактивным излучениям фотоэмульсии и получении отпечатка, фиксирующего расположение радиоактивных изотопов.

Культура клеток и тканей вне организма

Метод сохранения в жизнеспособном состоянии клеток, участков тканей, органов или их частей вне организма. Во 2-й пол. 19 в. развитие микробиологии, прежде всего медицинской (необходимость выделения и изучения микробов, вызывающих инфекционные болезни), а также производств, основанных на процессах брожения, привело к созданию методов культивирования клеток бактерий, дрожжей и других микроорганизмов, т.е. методов их выделения, выращивания, размножения и сохранения в искусственных условиях. Были разработаны составы жидких и твёрдых питательных сред, методы, обеспечивающие их стерильность, способы выращивания чистых культур, состоящих из клеток одного вида, и т.д. К сер. 20 в. было освоено культивирование микроорганизмов в промышленных масштабах.

Первые опыты по выращиванию клеток и тканей животных вне организма были сделаны в нач. 20 в. Дальнейшее совершенствование метода шло параллельно успехам цитологии, биохимии, генетики, эмбриологии, молекулярной биологии. Его возможности возросли после того, как научились получать изолированные клетки из различных животных тканей (путём их обработки специальными ферментами, растворяющими межклеточное вещество и разрушающими межклеточные контакты) и выяснили потребности разных клеток в гормонах, факторах роста и др. веществах, вносимых в искусственные питательные среды. Очевидные преимущества работы с генетически однородными клетками и тканями в контролируемых условиях вне организма по сравнению с проведением исследований на целых организмах сделали этот метод одним из наиболее универсальных в биологии. Столь же плодотворным оказалось его применение в медицине и при решении ряда задач сельского хозяйства и биотехнологии.

Клеточные и тканевые культуры использовались для изучения закономерностей митоза и числа клеточных циклов (делений) у клеток разных типов и выяснения в связи с этим «запрограммированности» процесса старения, для изучения механизмов клеточной дифференцировки, формирования специализированных тканей и органов, а также (при совместном культивировании) влияния друг на друга клеток разных типов. Культура клеток и тканей растений появилась позднее - в 1958 г., но уже всего через 6 лет из единственной клетки, извлечённой из корня моркови, удалось в условиях культуры вырастить целое растение с дифференцированными тканями и органами. Это направление широко применяется в селекции и биотехнологии.

Клеточные и тканевые культуры позволяют исследовать такие важные для медицины проблемы, как перерождение нормальных клеток в опухолевые, всесторонне изучать их свойства, чувствительность клеток к физическим и химическим факторам, в т.ч. к лекарствам, а также определять потенциальную мутагенность и канцерогенности этих факторов, т.е. их способность вызывать мутации и опухоли. Разработка методов дли-тельного культивирования позволяет формировать банки клеточных линий, обладающих определёнными генетическими и биохимическими свойствами. На этой основе создаются методы криоконсервации (от греч. «криос» - холод) - сохранение в условиях глубокого охлаждения клеток, тканей и органов для трансплантации (пересадки), в качестве резервного генофонда редких и исчезающих биологических видов, а также для других целей. С кон. 20 в. стали возникать банки, в которых хранятся замороженные стволовые клетки, используемые для лечения самых различных болезней и травм.

Клеточные культуры служат также удобными объектами для изучения тканевой несовместимости и других иммунных реакций. Они используются в диагностике вирусов и для получения вакцин. Таким образом, культура клеток и тканей применяется для решения как фундаментальных теоретических проблем (таких как клеточная дифференцировка и др.), так и различных практических задач, особенно в области медицины. Этот метод - неотъемлемая составная часть генной инженерии, клеточной инженерии, клонирования и других направлений экспериментальной биологии.

Прижизненная окраска

Явление окрашивания тканей при жизни организма путем введения в него различных красящих веществ. Красящие вещества должны быть не ядовиты для организма и обладать свойством проникать в ткани, а также удерживаться в них в течении определённого времени. Для окраски применяют кислые или основные краски.

Результаты, получаемые с кислыми красками, зависят не столько от их химического состава, сколько от степени дисперсности и других физико-химических свойств. Высоко дисперсные краски не дают окрашивания, а пропитывают диффузно ткани и быстро выделяются из организма. Поэтому для окрашивания применяют, преимущественно, коллоидные или полуколлоидные красящие вещества (Trypanblau, Isamin-blau), литиевый кармин и др. Всем этим краскам свойственна отрицательная зарядка частиц, медленность диффузии, нерастворимость в липоидах. После введения кислых витальных красок в организм наступает диффузное пропитывание ими основного вещества, а затем накопление краски в протоплазме определенных клеток организма в виде зернистых отложений. Так красятся лишь живые клетки (ядра при этом не окрашиваются). Мертвые клетки прокрашиваются очень резко диффузно, при чем красятся также и их ядра. Поэтому метод В. о. имеет большое значение для отличия живых клеток от мертвых. Далее, при помощи витальной окраски кислыми красками удается проследить процесс распределения в организме многих веществ, откладывающихся в тканях одинаковым образом с упомянутыми красками. Сюда относятся: желчные пигменты, коллоидные металлы и др. лекарственные вещества коллоидного характера, липоиды, а также, по-видимому, белковые тела, далее - различные бактерии, различные взвешенные частицы экзогенного происхождения, некоторые клеточные элементы и продукты их распада. Главным местом, где происходит отложение кислых витальных красок в зернистой форме, а ташке всех упомянутых сейчас веществ, являются клетки. Особенно характерно для окрашивания клеток кислыми красками то, что при этом никогда не прокрашиваются составные структурные части протоплазмы клеток. Появляющиеся в клетках окрашенные зерна образуются вследствие выпадения краски из растворенного состояния после проникания ее в клетки. Впрочем, кислыми красками пропитываются в известной степени также и некоторые преформированные внутриклеточные включения, особенно белкового характера. При окрашивании в клетках отлаживаются краски в зернистой формы. Механизм образования зерен краски в клетках объясняется различно: по одним взглядам, в клетках отмечается постепенное накопление краски внутри вновь образующихся вакуолей, где происходит постепенное понижение дисперсности краски и, наконец, ее выпадение, при чем имеет значение действие электролитов. Другие придают главное значение в образовании внутриклеточных зерен краски явлениям адсорпции. Далее, имеются указания, что краска проникает в клетки всегда в соединении с белками плазмы, т. о., содержание последних в крови имеет большое значение. Затем, в процессе В. о. кислыми, а также основными красками некоторую роль играет, повидимому, концентрация Н-ионов в тканях. Кроме клеток рет.-энд. системы, зернистые отложения кислых витальных красок образуются также в эпителии извитых канальцев почек (через к-рые, гл. обр., идет выделение этих красок), а также, хотя далеко не у всех животных, в клетках печени. При введении в организм больших количеств нек-рых витальных красок (напр., Trypanblau) удается получить зернистые отложения краски также и в других клеточных элементах, в особенности в эпителии энто-дермального происхождения (v. Mollendorff, Гессе, Глазунов и др.), в различных клетках промежуточной ткани, в клетках многих органов внутренней секреции, в эпителии сосудистых сплетений мозга и пр. Наконец, удавалось получить витальное окрашивание кислыми красками и элементов центральной нервной системы (Рахманов, Behnsen, Мандельштам и др.). В общем, на результат прижизненной окраски, кроме свойств красящего вещества, оказывают влияние также и способ введения краски, дозировка ее и, наконец, состояние самих тканей, особенно степень снабжения их кровью. Интересные результаты были получены при внутривенных введениях неядовитых кислых красок, при чем прослежена быстрота исчезновения их из крови (Оку-нев, Seyderhelm) и дальнейшая судьба в организме (Аничков, Теплов, Каган). При диффузном распределении краски в тканях особенно резко диффузно прокрашиваются стенки сосудов (Петров). При подкожном и внутрибрюшинном введении кислых витальных красок также удалось получить, но более медленно, общее окрашивание животных. При этом особенно резко окрашиваются элементы тканей на месте введения краски. Имеются указания, что при отложении зерен краски в клетках важное участие принимает ретикулярный аппарат клеток (Golgi), т. к. появление зерен происходит сначала всегда в области этого аппарата (работы Насонова, Хлопина, Ясвой-на). Высказывавшиеся прежде мнения, что при окраске кислыми красками прокрашиваются составные части клеточной протоплазмы, напр., митохондрии (Чашин, Stec-kelmacher), в наст, время б. ч. оставлены.- Кроме введения кислых витальных красок в организм, важное значение имеет метод культивирования тканей в плазме, содержащей данные краски-особенно Trypanblau (Hofmann, Максимов, Vetteri, Хлопин). При этом удается наблюдать В. о. клеток и изучать их и в живом состоянии. - Наконец, важен метод исследования при помощи прижизненной окраски живых тканей непосредственно под микроскопом, как это удалось на нек-рых объектах (легкие, мочевой пузырь, брыжжейка амфибий), при чем могут быть применены даже сильные иммерсионные объективы (работы Garmus"a, Von-willer"a, Венслава). Прижизненной окраски тканей эмбрионов при введении кислых красок в материнский организм не наблюдается, т. к. плацента не пропускает краски из крови матери. Для окраски тканей эмбрионов применяется введение красок в полость амниона или, у птиц, впрыскивание, например, в стенку аллонтоиса. Коллоидная краска Kongorot предложена специально для элективной прижизненной окраски амилоида (Bennhold); впрочем, такие же результаты дает и краска Trypanblau (Гер-ценберг). Несколько особняком стоит применение витальных красок для В. о. костей. К таким краскам относятся производные краппа, красящим началом которого является ализарин. Окраска костей основана на образовании соединения ализарина с кальцием, при чем окрашиваются лишь молодые растущие кости (Lieberkuhn, Fischel, Gottlieb). Нек-рые продукты, образующиеся в организме при пат. изменениях НЬ, дают такую же окраску костей, как ализарин. Сюда относится гематопорфирин, который, при избыточном образовании в организме, откладывается в костях, окрашивая весь скелет в резко коричневый цвет (Е. Fraenkel). Несколько особый метод прижизненной окраски представляет собой т.н. витальная хемоскопия по Карчагу (Karczag). Этот метод основывается на способности многих красок группы трифенилметана (например, кислый фуксин, LieMgrim, Wasser-blau) под влиянием нек-рых воздействий (напр., света, тепла, восстановляющих веществ и пр.) переходить в бесцветные карбиноловые соединения. После впрыскивания этих красок исследуют различные ткани, обнаруживая в них краску действием кислоты, к-рая «регенерирует> краску. В. о. основными красками. В отличие от кислых красок, основные окрашивают предсуществующие структурные составные части клеток. Предполагают, что при этом происходит осаждение краски кислыми коллоидами клеток (v. Mollendorff). В особенности резкое осаждение краски происходит при полной ее нейтрализации при избытке краски или кислого коллоида получаются различные цветовые оттенки окрашенных элементов, на чем основаны нек-рые методы определения концентрации Н-ионов в клетках. Основные краски обычно быстрее проникают в клетки и скорее осаждаются, чем кислые. Окрашивая структурные составные части клеток, они дают одинаковые результаты на живых и переживающих объектах. Поэтому они не могут быть вполне применены для отличия живых клеток от отмирающих в той степени, как кислые краски. В общем, для возникновения В. о. основными красками имеют значение следующие условия: диффузионная способность красок, от к-рой зависит быстрота окрашивания, растворимость в липоидах, способность краски к восстановлению, осаждаемость кислыми коллоидами и, наконец, содержание Н-ионов в тканях. Особенное значение придавали растворимости основных красок в липоидах. Скорость возникновения окраски в значительной степени ставили в зависимость от этого свойства, т. к. оно облегчает проникание краски в клетку через поверхностный липоидный слой (Over-ton, Hober, Nierenstein). Однако, когда выяснилось, что в клетки проникают также и нерастворимые в липоидах краски, указанный сейчас взгляд был сильно поколеблен. Наряду с физической проницаемостью клеток был выдвинут взгляд об особой их физиологической проницаемости (НбЬег). В наст, время значение липоидных компонентов клетки выступает в новом освещении в смысле возможности накопления краски на разделе липоид-протоплазма, вследствие способности красок понижать поверхностное натяжение на этом разделе (Окунев). Моментом, препятствующим возникновению В. о. основными красками, является свойство последних переходить путем восстановления в тканях в бесцветные соединения. Этим свойством красок пользуются также для определения мест наибольшего потребления кислорода в тканях (Ehrlich, Unna и др.). Составные части клеток, окрашивающиеся витально основными красками, представляют собой прежде всего различные включения. В этом отношении действие основных красок частью сходно с действием кислых. Далее, прижизненно окрашиваются основными красками секреторные зерна, желтковые пластинки, Нисслевская зернистость в нервных клетках, пищеварительные вакуоли у простейших и пр. Наблюдавшаяся Арнольдом (Arnold) окраска клеточных зернистостей основными красками относится не к пластосомам, а, гл. обр., также к секреторным зернистостям и включениям. Впрочем, при действии нек-рых основных красок (Janusgri"m) удается, особенно в культурах тканей, получить окраску пластосом. Т. о., основные витальные краски окрашивают все же, гл. обр., парапластические субстанции, т.е. такие, к-рые не принимают активного участия в клеточной жизни. Из наиболее употребительных для В. о. основных красок следует назвать Neutral-rot, Nilblausulfat, Methylenblau, Toluidin-falau, Thionin, Bismarekbraun, Krystallvio-iett и др. Все эти краски применяются обыч- но в сильно разведенных растворах. Особенно хорошие результаты дают Neutral-rot, Nilblausulfat и Methylenblau (многочисленные результаты окраски основными красками различных животных, начиная с простейших, см. в работах Nierenstein"a, Vonwiller"a, Loman"a, Stelanski, Fischel"H, Хлопина и др.). Весьма трудно во многих случаях отличить-имеет ли окраска какой-либо основной краской витальный или суп-равитальный характер. Обычно суправи-тальная окраска получается более резкая, при чем окрашиваются также и структурные элементы ядер. Представителем суправи-тальной окраски считается особенно окрашивание (неправильно назыв. «прижизненным») нервных волокон и окончаний по Эрлиху (подробнее об этом методе см. в работах Догеля и его школы). Обычно исследование тканей при окраске основными красками производится без фиксации, на расщипах тканей или на прозрачных перепонках, особенно у хладнокровных (см. работы Garmus"a, Vonwiller"a, Венслава). Далее, применяется также и метод выращивания тканей на плазме с прибавкой основных красок в весьма слабых разведениях (см. работы Vetter"a, R. Erdmann"a, Хлопина). Попытки фиксации основных красок в тканях не дали хороших результатов. Специального упоминания заслуживает прижизненная окраска жира, для чего применяется, гл. обр., краска Sudan III. Последний вводят в растворе в растительном масле через желудок или примешивают его в виде порошка к пище. В результате получается окраска всех жировых депо организма. Механизм распределения краски и проникания ее в жировые депо еще мало изучен (см. работы JakobsthaFfl, M. В. Schmidt"a и др.).

Методы исследования в гистологии, цитологии и эмбриологии Часть I

Ивановская государственная медицинская академия
Кафедра гистологии, эмбриологии и цитологии
Методы исследования в
гистологии, цитологии и
эмбриологии
Часть I
к.м.н., старший преподаватель М.Р. Гринева
д.м.н., профессор С.Ю. Виноградов
д.м.н., профессор С.В. Диндяев
далееВведение
Методы исследования живых клеток и тканей
Виды гистологических препаратов фиксированных клеток
Изготовление гистологического препарата
Гистологический препарат
Взятие материала
Фиксация материала
Уплотнение материала
Приготовление срезов
Виды микротомов
Окрашивание срезов
Методы окрашивания
Типы красителей
Заключение срезов в консервирующую среду
Методы микроскопии
Световая микроскопия
Устройство светового микроскопа
Техника микроскопирования
Темнопольная микроскопия
Поляризационная микроскопия
Фазово-контрастная микроскопия
Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия
Электронная микроскопия
Рекомендуемая литература
назад
далее

Введение

В современной гистологии, цитологии и эмбриологии применяются
разнообразные методы исследования, позволяющие всесторонне изучать
процессы развития, строения и функции клеток, тканей и органов.
Главными этапами цитологического и гистологического анализа являются
выбор объекта исследования
подготовка его к микроскопированию
применение методов микроскопирования
качественный и количественный анализ изображения
Объектами
исследования
служат
гистологические
изготовленные из живых или фиксированных клеток.
препараты,
оглавление далее

Методы исследования живых клеток и тканей

Изучение живых клеток и тканей позволяет получить наиболее полную
информацию об их жизнедеятельности – проследить процессы движения,
деления, разрушения, роста, дифференцировки и взаимодействия клеток,
продолжительность их клеточного цикла, реактивные изменения в ответ на
действие различных факторов.
Методы
Прижизненное
в организме (in vivo)
Вживление прозрачных камер
Прижизненная микроскопия
Трансплантация
Прижизненное в культуре
клеток и тканей (in vitro)
Суспензионные культуры
Монослойные культуры
Культивирование in vivo
назад
оглавление далее

Виды гистологических препаратов фиксированных клеток

Срез
тонкие (толщина
более 1 мкм)
полутонкие
(толщина менее
1 мкм)
ультратонкие
(толщина менее
0,1 мкм)
Мазок
крови
красного
костного
мозга
спинномозговой
жидкости
слюны
влагалищный
и др.
Отпечаток
селезенки
тимуса
печени
слизистой
оболочки
мочевого
пузыря
слизистой
оболочки
щеки
и др.
назад
Пленка
брюшины
плевры
мягкой мозговой
оболочки
соединительной
ткани
и др.
оглавление далее

Изготовление гистологического препарата

назад
оглавление далее

Гистологический препарат

Гистологические препараты, как правило, представляют собой срезы (толщиной
5-15 мкм) органов, тканей или клеток, окрашенные специальными гистологическими
красителями.
Гистологический препарат должен отвечать следующим требованиям:
сохранять прижизненное состояние структур;
быть достаточно тонким и прозрачным для изучения его под
микроскопом в проходящем свете;
быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под
микроскопом четко определяться;
препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и
использоваться для повторного изучения.
Процесс изготовления гистологического препарата включает включает следующие
основные этапы:
1. Взятие и фиксация материала
2. Уплотнение материала
3. Приготовление срезов
4. Окрашивание срезов
5. Заключение срезов в прозрачную среду
назад оглавление далее

Взятие материала

Изготовление гистологического препарата производится из органов и тканей,
полученных несколькими путями:
биопсия (пунктат),
операционным путем,
секционный (трупный) материал,
экспериментальный
При этом должны учитываться следующие моменты:
1. Забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти
или забоя экспериментального животного, а при возможности от живого
объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или
органа.
2. Забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не
травмировать ткани.
3. Толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий
раствор мог проникнуть в толщу кусочка.
4. Обязательно
производится
маркировка
кусочка
(указывается
наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата
забора и так далее).
назад оглавление далее

Фиксация материала

Цель фиксации материала – сохранение прижизненного морфологию
клеток и тканей, предотвращение аутолиза и посмертных изменений.
Фиксатор вызывает денатурацию белка и стабилизацию липидов и тем
самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их
прижизненном состоянии.
Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие
жидкости, которые могут быть простыми (формалин, спирты, глутаровый
альдегид, ацетон) и сложными (раствор Карнуа, фиксатор Ценкера и др.).
Фиксация может достигаться также замораживанием (охлаждением в струе
СО2, жидким азотом и др.).
Подбор фиксаторов и продолжительность фиксации индивидуален для
различных органов и тканей и обычно колеблется от 2 до 24 часов.
назад оглавление далее

Уплотнение материала

Целью этого этапа является придание исследуемому материалу такой
плотности, которая позволит получить тонкие срезы необходимой толщины.
Этого достигают двумя способами:
Замораживание образца с последующей резкой на замораживающем
микротоме.
Пропитывание уплотняющими средами (парафин, эпоксидные смолы и др.)
Основные этапы парафиновой проводки:
Промывка материала проточной водопроводной водой для удаления
фиксатора.
Обезвоживание (дегидратация) материала в спиртах увеличива-ющейся
концентрации (70, 80, 90, 96, абсолютный – 100%).
Удаление спирта и подготовка материала к пропитыванию парафином
обработкой растворителями парафина (ксилол и др.) и смесью парафина и
ксилола (при температуре 37°С)
Заливка в чистый расплавленный парафин (при температуре 56°С).
Охлаждение парафина и формирование блоков.
назад оглавление далее

Приготовление срезов

Для изготовления тонких срезов заданной толщины в настоящее время
используются специальные приборы – микротомы (для световой микроскопии)
и ультрамикротомы (для электронной микроскопии).
Специальные ножи микротомов позволяют получить срезы толщиной:
3-8 мкм из материала, залитого в парафин,
10-25 мкм из материала, замороженного в камере микротома-криостата
0,08-0,1 мкм из материала, подготовленного для электронной микроскопии
Полученные срезы помещают на предметные стекла (для световой
микроскопии) или монтируются на специальные сеточки (для электронной
микроскопии).
назад оглавление далее

Виды микротомов

санный
ротационный
криостатный
замораживающий
для экспрессдиагностики,
гистохимии
вибротом
изготовление
парафиновых
срезов
изготовление
серийных
парафиновых
срезов
изготовление
срезов при
температуре
-20°С и ниже
для гистохимии
и иммуноцитохимии
изготовление
срезов фиксированных и
нефиксированных тканей
назад оглавление далее

Окрашивание срезов

Клеточные
структуры
без
специальной
обработки,
как
правило,
не
различимы даже при большом увеличении микроскопа. Они бесцветны и
прозрачны.
Для выявления тканевых компонентов, отдельных клеток, внутриклеточных
структур используют красители – вещества с высоким сродством к различным
компонентам ткани и с определенными цветооптическими свойствами.
Способность тканевых компонентов по-разному окрашиваться зависит от
кислотно-основных (щелочных) свойств веществ, входящих в их состав.
Перед окрашиванием срезы депарафинируют, проводя последовательно
через растворитель парафина (ксилол), спирты нисходящей концентрации (100,
96, 90, 80, 70%) и помещают в воду.
назад оглавление далее

Методы окрашивания

Общегистологические
Специальные
Гистохимические
выявление
общего плана
строения
клеток, тканей,
органов
выявление
специализированных
структур в
клетках и
тканях
анализ
химического
состава клеток
и
межклеточного
вещества
назад
Импрегнация
выявление
специализированных
структур в
клетках и
тканях
оглавление
далее

Импрегнация

Метод выявления тканевых структур путем пропитывания объектов
гистологического исследования растворами солей тяжелых и драгоценных
металлов (например, азотнокислое серебро (серебрение), кобальт, хлористое
золото (золочение), кадмий, осмиевым ангидрид и др.).
Участки ткани, в которых происходит осаждение солей металлов на
гистологических структурах, приобретают черный или бурый цвет в
зависимости от количества и свойств восстановленного металла.
Периферический нерв
(поперечный срез).
Импрегнация оксидом
осмия
Мультиполярный нейрон.
Импрегнация нитратом серебра
Мультиполярные нейроны.
Импрегнация нитратом серебра
назад оглавление далее

Типы общегистологических красителей

основные
основания,
связываясь с
кислотными
соединениями
гистологических
структур, вызывают
обычно их
окрашивание в синефиолетовые цвета
базофилия
метахромазия
нейтральные
кислые
содержат как
основные, так и
кислые красящие
компоненты
соединяясь с
основными
(щелочными)
соединениями
гистологических
структур,
окрашивают их в
цвета красителя
нейтрофилия
оксифилия
назад
оглавление далее

Базофилия

Основные (щелочные) красители активно связываются со структурами, которые
содержат кислоты и несут отрицательный заряд – например, ДНК, РНК.
К ним, в частности, относятся гематоксилин, толуидиновый синий, тионин,
метиленовый синий, азуры и др.
Способность окрашиваться основными (щелочными) красителями называется
базофилией (от греч. basis – основа и philia – любовь).
Поэтому структуры, связывающие эти красители, называются базофильными.
В клетке базофилией обладает ядро (вследствие высокого содержания ДНК и РНК),
иногда цитоплазма (при высоком содержании в ней рибосом или гранулярной ЭПС).
Базофильно может окрашиваться межклеточное вещество некоторых тканей – например,
хрящевой.
Базофилия ядра
нейтрофильного гранулоцита.

Увеличение: х630.
назад
оглавление далее

Метахромазия

Метахромазия (от греч. meta – изменение и chroma – цвет, краска) – изменение цвета
некоторых основных красителей при их связывании со структурами, обладающими
специфическими химическими свойствами (обычно высокой концентрацией
сульфатированных гликозаминогликанов).
К таким красителям относятся толуидиновый синий, азур II, тионин и др.
Способность метахроматически окрашиваться обладают гранулы базофильных
лейкоцитов, тучных клеток.
Указанные красители окрашивают другие базофильные структуры в тех же тканях в
обычный свойственный им цвет, т.е. ортохроматически (от греч. orthos – правильный и
chroma – краска).
Метахромазия зернистости
базофильного гранулоцита.
Окраска по Романовскому-Гимзе.
Увеличение: х630.
назад оглавление далее

Оксифилия

Кислые красители связываются со структурами, имеющими положительный заряд –
например, белки.
К таким красителям относятся эозин, оранж G, эритрозин, пикриновая кислота и др.
Способность окрашиваться кислыми красителями называется оксифилией, или
ацидофилией (от греч. oxys или лат. acidus – кислый и греч. philia – любовь).
Структуры, связывающие
ацидофильными.
эти
красители,
называются
оксифильными
или
Оксифилия свойственна цитоплазме клеток (особенно при высоком содержании в
ней митохондрий и некоторых белковых секреторных гранул), эритроцитам (благодаря
высокой концентрации в них гемоглобина). Оксифильно окрашивается цитоплазма
кардиомиоцитов, мышечных волокон скелетной мускулатуры, некоторые компоненты
межклеточного вещества (например, коллагеновые волокна).
Оксифилия зернистости
эозинофильного гранулоцита.
Окраска по Романовскому-Гимзе.
Увеличение: х630.
назад
оглавление далее

Нейтрофилия

Нейтрофилия
(от
лат.
neutrum
–
ни
тот,
ни
другой,
и
philia - предрасположение, любовь) – способность гистологических структур
окрашиваться и кислыми, и основными красителями.
Нейтрофилия зернистости
нейтрофильного гранулоцита.
Окраска по Романовскому-Гимзе.
Увеличение: х630.
назад
оглавление далее

Заключение срезов в консервирующую среду

Окрашенные гистологические препараты обезвоживаются в спиртах
восходящей концентрации (70, 80, 90, 96, абсолютный – 100%) и
просветвляются в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах.
Для длительного хранения обезвоженный гистологический срез заключают
(монтируют) в прозрачную консервирующую среду (смолу хвойных деревьев –
канадский, пихтовый бальзам, а также в синтетические среды).
На постоянном гистологическом препарате срез ткани располагается на
предметном стекле, сверху закрыт покровным стеклом. Между стеклами
(предметным и покровным) находится заливочная среда, обладающая
коэффициентом преломления световых лучей, близким к таковому у стекла.
назад оглавление далее

Методы микроскопии

оглавление далее

Методы микроскопии

Оптическая
Световая
Поляризационная
Темнопольная
Фазовоконтрастная
Электронная
Просвечивающая
(трансмиссионная)
Сканирующая
(растровая)
Флюоресцентная
(люминесцентная)
назад оглавление далее

Световая микроскопия

Изучение гистологического препарата осуществляется в проходящем свете
с помощью светового микроскопа.
Источник света естественный или искусственный (различные лампы). Свет
собирается в конденсор и далее направляется через препарат в объектив.
Окуляр дополнительно увеличивает это изображение.
Качество
изображения
(четкость)
определяется
разрешающей
способностью микроскопа, т.е. минимальным (разрешающим) расстоянием,
на котором оптика микроскопа позволяет различить раздельно две близко
расположенные точки. Эта величина пропорциональна длине световой волны и
для обычного светового микроскопа равна приблизительно 0,2 мкм.
Чем меньше разрешающее расстояние, тем выше разрешающая способность
микроскопа и тем более мелкие объекты можно исследовать.
Увеличение микроскопа – это соотношение между истинными размерами
исследуемого объекта и размерами его изображения, получаемого с помощью
микроскопа. Ориентировочно оно оценивается как произведение увеличений
объектива и окуляра и может достигать 2500 раз.
назад оглавление далее

Устройство светового микроскопа

4
3
5
2
6
7
8
1
12
11
10
9
Основание микроскопа
Тубусодержатель
Тубус
Окуляр (чаще ×7)
Револьвер микроскопа
Объективы
а) сухие: ×8, ×20, ×40
б) иммерсионный ×90
7. Предметный столик
8. Конденсор
9. Макрометрический винт
10.Микрометрический винт
11.Винт конденсора
12.Зеркало
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Общее увеличение микроскопа = увеличение объектива × увеличение окуляра
назад
оглавление далее

Техника микроскопирования

1. Микроскопирование гистологического препарата начинают с установки правильного
освещения. Для этого с помощью вогнутого зеркала, собирающего рассеянный пучок
света, и конденсора достигают равномерного освещения поля зрения.
2. На предметный столик помещают гистологический препарат покровным стеклом вверх.
3. Изучение гистологического препарата начинают при малом увеличении (объектив х8), при
этом расстояние между объективом и покровным стеклом должно быть около 1 см.
Установку резкости проводят с помощью макровинта.
4. Рассматривают детали гистологического препарата по всей площади, перемещая его на
предметном столике.
5. Устанавливают в центр поля зрения участок гистологического препарата, который следует
изучить при большом увеличении (объектив х40).
6. С помощью револьверного устройства ставят объектив с более сильным увеличением
(х40). Установку резкости проводят с помощью микровинта.
7. Для изучения очень мелких гистологических структур используют иммерсионный
объектив (х90).
На покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионного масла.
Осторожно опускают тубус до соприкосновения линзы объектива к маслу.
Установку резкости проводят с помощью микровинта.
После окончания работы иммерсионное масло удаляют с объектива и покровного
стекла марлей.
назад оглавление далее

Техника микроскопирования (примеры)

Почка.
Окраска: гематоксилин-эозин.
Увеличение: х 56
(малое увеличение).
Почка.
Окраска: гематоксилин-эозин.
Увеличение: х 280
(большое увеличение).
Почка.
Окраска: гематоксилин-эозин.
Увеличение: х 630
назад
(иммерсионное
увеличение).
оглавление далее

Темнопольная микроскопия

Основана на использовании специального конденсора, освещающего
препарат «косыми» лучами, не попадающими в объектив.
При наличии объекта в поле зрения свет отражается от него и
направляется в объектив.
Метод часто используется для изучения живых неокрашенных клеток.
назад
оглавление далее

Поляризационная микроскопия

Позволяет обнаружить двойное лучепреломление – анизотропию.
На объект исследования направляется поляризованный пучок света, т.е. лучи света
направлены строго в одной плоскости.
Это обеспечивает особый фильтр – поляризатор. Такой свет направляется на объект
исследования.
Второй фильтр – анализатор расположен между объективом и окуляром и позволяет
регистрировать угол отклонения плоскости поляризации света.
Микроскопия позволяет регистрировать пространственное расположение молекул в
объективе или кристаллические структуры.
Кристаллы оксалатов.
Поляризационная
микроскопия.
Увеличение х100
назад оглавление далее

Фазово-контрастная микроскопия

Метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных объектов, в
частности, позволяет изучать живые неокрашенные препараты.
Даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата
световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает
фазовый рельеф). Эти фазовые изменения, не воспринимаемые глазом, преобразуются с помощью
специального оптического устройства (кольцевой диафрагмы в конденсоре и фазовой пластинки в
объективе) в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный
рельеф»), которые уже различимы глазом.
Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд)
воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазовоконтрастным.
Pseudotrichonympha grassi.
Неокрашенный препарат.
Фазовый контраст
Семенники крысы.
Неокрашенный препарат.
Фазовый контраст
Семенники крысы.
Окраска: гематоксилин-эозин
Световая микроскопия
назад оглавление далее

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия

Использует принцип свечения объекта исследования при освещении его
ультрафиолетовыми лучами. Источником света служат специальные лампы.
Существует аутофлюоресценция – собственная или первичная
флюоресцен-ция. Например, свечение эластических волокон в стенке артерий.
Вторичная флюоресценция возникает после обработки препаратов
специальными красителями – флюорохромами (акридин оранжевый, родамин,
флюоресцин и др.).
Например: после обработки акридиновым оранжевым в клетке очень четко
обнаруживается ядерная ДНК (ярко-зеленое свечение) и РНК (ярко-красное
свечение). После фиксации тканей в парах формальдегида (метод Фалька)
обнаруживается
ярко-зеленое
свечение
серотонина,
катехоламинов
(адреналин, норадреналин).
Если флюоресцентные красители связать со специфическими антителами
– можно будет выявить их антигены. Этот метод получил название
иммуноцитохимического.
назад оглавление далее

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия (примеры)

.
.
.
.
Цитоскелет эукариот
(эндотелиальные клетки быка).
Имунноцитохимический метод
окрашивания.
Актиновые микрофиламенты
окрашены в красный,
микротрубочки - в зеленый, ядра
клеток - в голубой цвет.
Нуклеиновые кислоты
в эпителии маточных
желез.
Окраска акридиновым
оранжевым.
Ядерная ДНК окрашена в
зеленый цвет,
РНК – в красный.
назад
Симпатические
нервные сплетения.
Метод Фалька
оглавление далее

Электронная микроскопия

Электронный микроскоп - прибор, позволяющий получать изображение объектов с
максимальным увеличением до 106 раз. Это стало возможно благодаря использованию
вместо светового потока пучка электронов, длина волны которого во много раз короче
длины волны фотонов видимого света.
Электронный микроскоп состоит из электронной пушки (устройства для получения
пучка электронов) и системы электромагнитных линз, размещенных в колонне
микроскопа в условиях вакуума.
Разрешающая способность электронного микроскопа в 1000÷10000 раз превосходит
разрешение светового микроскопа и для лучших современных приборов может
составлять менее 0,1 нм (10-10м).
Существуют
две
основные
разновидности
электронной
трансмиссионная (просвечивающая) и сканирующая (растровая).
назад
микроскопии:
оглавление далее

Трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия

Принцип работы трансмиссионного электронного микроскопа заключается в том, что
электроны, проходя через объект, расположенный вблизи объективной линзы,
взаимодействуют с его атомами и отклоняются от первоначального направления падения
пучка (рассеиваются). Далее они попадают в систему магнитных линз, которые
формируют на флуоресцентном экране (и на фотопленке) изображение внутренней
структуры объекта. При этом удается достичь разрешения порядка 0,1 нм, что
соответствует увеличениям до 1,5 106 раз.
Разрешение и информативность ТЭМ-изображений во многом определяются
характеристиками объекта и способом его подготовки. Для получения контрастного
изображения применяют ультратонкие срезы (не более 0,01 мкм), обработанные
соединениями тяжелых металлов (импрегнация солями свинца, урана, осмия и др.),
избирательно взаимодействующими с компонентами микроструктуры (химическое
контрастирование). При этом чем большей рассеивающей способностью обладает
участок исследуемого объекта (участки повышенной плотности, увеличенной толщины и
пр.), тем более темным будет его изображение.
назад оглавление примеры

Сканирующая (растровая) электронная микроскопия

Принцип работы сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) заключается в
сканировании поверхности образца сфокусированным электронным пучком и анализе
отраженных от нее частиц и рентгеновского излучения, возникающего в результате
взаимодействия электронов с веществом.
В СЭМ пучок электронов (электронный зонда) фокусируется электромагнитными
линзами конденсора и объектива. Специальное устройство – дефлектор отклоняет
электронный пучок (первичные электроны), который скользит по поверхности (растр).
Вторичные электроны (отраженные от поверхности) воспринимаются детектором и
фокусируются на экране СЭМ, создавая ее трехмерное изображение.
Современный СЭМ позволяет работать в широком диапазоне увеличений
приблизительно от х10 (что эквивалентно увеличению сильной ручной линзы)
до х1 000 000, что приблизительно в 500 раз превышает предел увеличения лучших
оптических микроскопов.
Поверхность сканирования обязательно напыляется металлом: платина, золото,
палладий и др.
назад оглавление примеры

Электронная микроскопия (примеры)

трансмиссионная
сканирующая
.
.
.
Эритроциты в артериоле
.
.
.
Тучная клетка
назад
Эритроцит,
тромбоцит,
лейкоцит
оглавление
далее1. Гистология, цитология и эмбриология: Учебник. / Под ред. Ю.А.Афанасьева,
С.Л.Кузнецова, Н.А.Юриной. – М.: Медицина, 2006. – 768 с.
2. Гистология, эмбриология, цитология: Учебник. /
Ю.А.Челышева. – М.: «ГЭОТАР-Медиа», 2007. – 408 с.
Под
ред.
Э.Г.Улумбекова,
3. Жункейра Л.К., Карнейро Ж. Гистология: Атлас: Уч.пос.; пер. с англ., под ред. В.Л.
Быкова. – М.: «ГЭОТАР-Медиа», 2009. – 576 с.
4. Хэм А., Кормак Д. Гистология: в 5 томах; пер. с англ. – М.: Мир, 1982.
назад
оглавление